【论文大全】导语，大家所阅览的此篇共有7281文字，由袁建良详细厘正，上传于范万文网！范万文小百科：发生率（Incidence）是一个统计学词汇，指在某时间内一组人群发生新的例数。加速康复外科在卵巢癌围手术期的应用_妇产科学论文欢迎收藏，希望对你有帮助！
【关键词】 加速康复外科;卵巢癌;围手术期;并发症;康复
【摘要】 目的 探讨加速康复外科在卵巢癌围手术期的可行性、安全性及有效性。方法 选择40例行初次手术治疗的卵巢癌患者，分别采用加速康复外科治疗(加速康复组，20例)及传统围手术期治疗(传统组，20例)，比较两组患者肠道功能恢复时间、并发症、术后住院天数或术后至开始化疗前天数。结果 加速康复组肠功能恢复提前于传统组，差异具有显著性(p<0.05);两组患者并发症发生率差异无显著性(p=0.418);加速康复组患者平均术后住院天数或术后至开始化疗时间明显少于传统组，差异具有显著性(p=0.002)。结论 加速康复外科应用于卵巢癌围手术期，安全可行，术后康复加快，早日进行化疗。
【关键词】 加速康复外科;卵巢癌;围手术期;并发症;康复
[abstract] objective to investigate the feasibility, safety and availability of fast-track surgery(fts) for ovarian cancer.methods forty ovarian cancer patients underwent surgery were divided into two groups. twenty cases (fts group) were treated with the concept of fts and the others (traditional group) were treated with the traditional methods of operation as control group. the time of functional recovery of intestinal tract, the incidence of complications, and the hospital stay(or the hospital time before chemo)after surgery were compared, respectively.results significant differences were not observed between the two groups in the incidence of overall complications(p=0.418). there were significant differences between the fts group and the traditional group in the functional recovery of intestinal tract(p<0.05) and the hospital stay(p=0.002).conclusion the fast-track surgery can accelerate recovery after surgery for ovarian cancer with shorter hospital stay(or the hospital time before chemo) and lower cost during hospitalization during the perioperative period.
[key words] fast-track surgery;ovarian cancer;perioperative period; complication; rehabilitation
近年来，自普外科始加速康复外科(fast-track surgery, fts)的理念和意义越来越受到外科医师的关注。wWw.0519news.cOmfts是将麻醉学、疼痛控制及外科手术方式等方面的新技术与传统术后护理方法的改进相结合，降低术中、术后应激反应、降低术后并发症发生率及死亡率，以达到促进患者术后尽快康复、缩短术后住院时间和减少住院费用的目的。
20xx年1月-20xx年6月，笔者将fts的方法应用于卵巢癌患者围手术期，效果满意，并与同期应用传统方案治疗患者进行了对比，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取行初次手术治疗的卵巢癌患者40例，fts组及传统组各20例。fts组(47.4±8.6)岁，体重(50.8±15.6)kg，传统组(43.5±6.5)岁，体重(48.5±17.8)kg。肿瘤分期:fts组ⅰa期1例，ⅰb期2例，ⅰc期5例，ⅱa期3例，ⅱb期2例，ⅱc期1例，ⅲb期2例，ⅲc期4例;传统组ⅰa期2例，ⅰb期2例，ⅰc期4例，ⅱa期3例，ⅱb期3例，ⅱc期2例，ⅲb期1例，ⅲc期3例。病理诊断：fts组浆液囊腺癌10例，黏液性囊腺癌4例,子宫内膜样癌4例,未分化癌2例;传统组：浆液囊腺癌8例,黏液性囊腺癌5例,子宫内膜样癌5例,未分化癌1例,透明细胞癌1例。两组在年龄、体重、肿瘤分期及病理等方面，差异无显著性。
1.2 术前准备
(1)fts组采用术前1天流质饮食，聚乙二醇电解质3～4盒导泻，术前2h服用10%葡萄糖溶液200ml;(2)传统组术前2～3天进流质，术前清洁灌肠，术前6h禁饮食。
1.3 术中处理
fts 组采用硬膜外麻醉方法，控制补液量(30ml/kg);术中保温，应用超声刀进行分离组织，不常规放置引流管;对照组采用全麻、术中不控制补液量、不采取保温、 常规放置引流管，其他处理两组均相同。
1.4 术后处理
fts组：术后采用自控镇痛泵(pca)，导尿管术后第1天清晨夹闭尿管训练膀胱，第2天拔除尿管;患者清醒后开始床上活动，术后第1天床上坐起活动，第2天开始下床活动，每日不低于6h，由医护人员督促进行;术后6h后拔除胃肠减压管并饮少量水;术后第1天进无渣流质，分次口服瑞素(华瑞制药)250～500ml，第2天进流质饮食(同时500～1000ml瑞素分次口服);第3天进半流质并逐渐过渡到普通饮食，进食期间仍给予500～1000ml瑞素，直至全量普食，液体量不足部分由静脉补充;传统组：术后肌注哌替啶止痛，胃肠减压管在排气后拔除，导尿管留置3～4天，患者在各种引流管拔除之前以床上活动为主，之后下床自由活动，患者活动量自我掌控;患者排便前应用全胃肠外营养(tpn)，排便后开始进流质，以后逐渐转为半流质、普通饮食。
1.5 观察指标
观察并记录患者首次排气、排便时间，恶心、腹胀、呕吐发生率，术后并发症发生率，住院天数或术后至行化疗天数等。
1.6 出院或开始行化疗标准
(1)体温正常;(2)胃肠道功能恢复，经口进食能满足自身代谢需求;(3)切口及腹、盆腔无疼痛;(4)血常规、血生化检查无明显异常。
1.7 统计学处理
采用spss11.5统计软件包处理数据。术后排气和排便时间用mann whitney test 方法进行统计;总并发症发生率采用chi squar test 方法检验，住院天数采用independent samples test检验。p<0.05为差别有统计学意义。
2 结果
fts组及传统组术后首次排气、排便时间，总并发症、住院天数及住院费用等情况的比较，见表1。表1 fts组与传统组术后指标的比较
3 讨论
3.1 术前准备
3.1.1 肠道准备
传统术前准备时间长、患者痛苦大。长时间流质、禁食使患者手术耐受力降低，清洁灌肠易引起患者电解质紊乱、肠道菌群失调。 1天肠道准备法简单易行，能达到手术要求，预防患者电解质失衡，可提高手术耐受力，降低并发症发生[1]。
3.1.2 饮食准备
传统术前禁饮食是择期手术的常规，diks等[2]认为禁食可很快消耗掉肝糖原，从而使肌肉力量降低，影响单核细胞功能，容易使肠道菌群易位,不利于患者术后恢复。fts组中术前2h饮用200ml碳水化合物饮料，可缓解患者口渴感、饥饿感和焦虑情绪,降低术后高血糖症的风险[3]。在本fts组，术中未发现因饮用葡萄糖水而发生呕吐。
3.2 术中处理
3.2.1 麻醉选择
传统卵巢癌手术常采用全身麻醉，全麻会增加肺部感染的风险,延长手术后肠功能恢复时间。选择t6～t10脊椎间隙硬膜外麻醉不但可以达到理想的麻醉效果,而且可以通过阻断交感神经减轻手术应激反应[4]，降低并发症的发生。
3.2.2 术中补液及保温
传统方法手术过程中给予大量液体输入,有时可达4000～6000ml，使身体处于一种过度补液状态,增加心肺功能障碍的发生率，可造成组织间液积聚、肠壁水肿,影响术后胃肠蠕动的恢复。
寒冷以及术中大量凉液体的输入可加强患者的应激反应，本研究中fts组采用保温措施对输注液体加温以及限制液体输入可显著减轻手术应激反应。术中及术后早期的保温,具有减少术中出血、术后感染、心脏并发症,以及降低分解代谢的作用[5]。
3.3 术中处理
开腹手术中采用超声刀，相对于电刀，对于周围组织损伤小，术后创面渗血、渗液减少等优点[6]，可有效减轻手术应激反应，促进术后恢复，是微创理念在开放手术中的重要应用。
3.4 术后处理
3.4.1 引流管的放置
传统手术认为放置引流管可引出术区渗液,减少腹腔感染的发生;放置鼻胃管行胃肠减压，可以缓解腹胀，有助于胃肠功能的恢复;但这些措施并没有减少并发症的发生[7],在本观察中，fts组不常规放置引流管，患者清醒后拔除胃肠减压管，术后48h内拔除导尿管，没有增加腹腔感染的发生，却有效地减少了肺感染、泌尿系感染，促进了患者早期活动及胃肠功能的恢复。
3.4.2 术后止痛
充分止痛是有利于早期下床活动及早期口服营养的必要前提，是减少手术应激反应重要环节。传统术后使用等阿片受体激动剂,止痛效果好,但会抑制患者的呼吸、延长术后肠麻痹时间。本观察表明, 术后采用自控镇痛泵，可以达到很好的止痛效果,减少了阿片类物质的应用,从而相对加快了胃肠功能恢复。
3.4.3 术后活动
术后早期下床活动的益处及其重要性早已被人们达成共识。在fts组患者清醒后即开始督促其床上活动，术后第2天开始下床活动，整个过程由医护人员鼓励、督促进行，循序渐进，相对于传统组，有效地促进了患者术后康复。
3.4.4 营养支持
传统做法是给予静脉营养支持,价格昂贵而且副作用较多。研究表明术后早期进食安全可行,患者耐受情况良好[8]。本研究中，早期应用要素饮食，其营养较全面，既可补给患者需要的热量、氨基酸和蛋白质，还可供给水溶性、脂溶性维生素以及微量元素，并逐渐由要素饮食过渡到正常饮食，不但可以避免静脉营养的副作用、节省费用减轻患者经济负担,而且更重要的是还可通过促进胃肠蠕动,改善患者营养,增强患者的抗感染能力,减少相关并发症的发生。 fts组首次排气、排便时间明显优于传统组(p=0.028,p=0.033)。
3.5 术后并发症
在研究中，fts组总的并发症发生率低于传统组，尤其是心、肺疾患发生率在fts组发生率较低，此与术前肠道准备、麻醉选择、术中保温减少应激、无鼻胃管、术后早下床活动和及早进食有明显的关系。但两组比较差异无显著性，可能与本研究例数少有关。
3.6 住院时间
应用fts理念，患者术前肠道准备时间缩短，术后有效的止痛、营养支持和进食、及早活动和并发症的减少，使得术后恢复时间缩短，因此fts组住院平均时间较传统组缩短3天，为患者及时转入下一步放化疗做好了准备。
fts目的是通过减少并发症、提供更好地预后来改善外科手术治疗，促进患者康复，而不仅仅是为了早期出院[5]。本研究旨在观察fts的有效性和安全性，所有患者均为机体基础条件较好患者。我国的fts的研究刚刚起步，如何将fts理念应用于更多外科领域的更多患者，需要多学科、更多研究人员以及大样本的进一步研究，以期更多患者受益。
【参考文献】
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摘要】 根据小儿“脾常不足”的生理特点，张教授从脾失健运、湿热内蕴，又兼外受风邪、内外两邪相搏、风湿热邪浸淫肌肤来辨证，用“四妙丸”加减治疗婴儿湿疹，取得满意疗效。并附2则验案以资验证。
【关键词】 张士卿；婴儿湿疹；临床经验
张士卿教授乃全国名中医，师从中医临床大家王伯岳、于己百等人，从事中医儿科临床、教学研究近40载，博览群籍，笃于实践，学验俱丰且善用经方验方。张教授根据自己多年临床经验用“四妙丸”加减治疗小儿湿疹取得满意疗效，笔者有幸随其临诊，受益颇丰。现择张教授治疗湿疹经验介绍如下。
1病因病机
婴儿湿疹是一种常见的、由多种因素引起的具有明显渗出倾向的皮肤炎症反应,俗称“奶癣”“胎敛疮”。中医古代文献对湿疹早有认识，如《外科正宗》记载：“儿生胎中，母食五辛，父餐炙煿遗热与儿，生后头面遍身发为奶癣，流脂成片，睡卧不安，瘙痒不绝。”《医宗金鉴》认为其病机“由心火脾湿受风而成”。此病近年来在婴幼儿发病中有逐渐上升趋势,而且易成慢性反复发作。尤其体胖婴儿多发，皮损多分布于头面等部位，严重者可侵延颈部、肩胛部，甚至遍及全身。《医宗金鉴·外科心法要诀》记载:“胎敛疮，此症生婴儿头顶，或生眉端，又名乳癣，痒起白屑，形如癣疥，由胎中血热，落草受风缠绵，此系干敛，有误用烫洗，皮肤起粟，搔痒无度，黄水浸淫，延及遍身，即成湿敛。WWw.0519news.CoM”明确指出本病多因胎中遗热遗毒，或饮食失调、脾失健运、内蕴湿热、外受风湿热邪而致。属中医学胎毒、湿毒范畴。其中湿邪为发病的主要因素，由于湿性黏滞重着，易留难去，故湿邪引起的皮肤病，病情缠绵，难以速愈。
张教授认为婴儿湿疹主要原因在于孕母在孕期或新生儿期恣意饮食,过食辛辣荤腥动风之物，伤及脾胃，致使脾失健运，湿热内蕴。又兼外受风邪，内外两邪相搏，浸淫血脉，内不得疏泄，外不得透达，郁于肌肤腠理之间，故皮肤疹出色红瘙痒或津水流溢。张教授认为治疗应以清热利湿止痒为主要治法，故选用四妙丸加减治疗婴儿湿疹取其清利湿热、祛风止痒、燥湿健脾之意。
四妙丸原方是在《丹溪心法》二妙散的基础上加了牛膝和薏苡仁。方中以黄柏为君，其性苦寒，取其寒以胜热，苦以燥湿，既能清热燥湿又能泻火解毒。臣以苍术，因其辛散苦燥长于祛湿，因湿自脾来故，取其燥湿健脾，使湿邪去而不再生。佐以牛膝，性善下行，能补肝肾，祛风湿，引药下行使湿自下去。薏苡仁取其甘补淡渗，健脾燥湿，对于脾虚湿滞者尤为适用。又因其性偏凉，能清利湿热。四药共用，标本兼顾，使湿热得除。
张教授运用此方治疗婴儿湿疹往往根据患儿具体情况随证加减。如瘙痒甚加荆芥、防风，由于痒自风来，故止痒必先疏风，疏风止痒以祛除在表之风邪。面部湿疹严重者加薄荷、板蓝根，薄荷散头面风热；板蓝根可上行清热解毒。疹色红甚、热毒重者加蒲公英、野菊花以加强清热解毒之力。湿热重加车前子渗湿泄热，导湿热下行从水道而去，使邪有出路。加赤芍或牡丹皮行气通络，活血散瘀，气行则营卫畅通，营卫畅通则邪无滞留。
2典型案例
验案1 患儿吴某，男，3月，20xx年12月16日就诊。家长代诉，患儿出生1月头面部出现红色皮疹，瘙痒甚，后患部破溃流水，形成黄色结痂，愈后复出，舌红苔黄。张教授治以祛风止痒、利水渗湿、燥湿健脾。四妙丸加减：苍术6 g、黄柏6 g、白鲜皮10 g、地肤子10 g、茯苓15 g、薏苡仁30 g、蒲公英15 g、车前子10 g（包）、滑石15 g（包）、炒防风6 g、川萆薢10 g、炒山药15 g、甘草6 g、白蒺藜10 g。3剂，2 d 1剂，水煎服。服后没有新的皮疹出现，破溃减少，结痂明显脱落，瘙痒减轻。6 d后复诊时，去滑石、川萆薢，加薄荷6 g(后下)、金银花10 g，继服3剂，2 d 1剂，最后药渣泡水用纱布蘸取轻敷患部。6 d后诸症明显好转，上方去白蒺藜，加牡丹皮6 g、赤芍6 g，2剂，按上述方法继服，诸症悉除。
按
患儿脾失健运，湿热内蕴，浸淫血脉，内不得疏泄，外不得透达，郁于肌肤腠理之间，故见皮肤出现红色皮疹，破溃流水，形成黄色结痂。治以疏风止痒、利水渗湿、燥湿健脾。方中黄柏既能清热燥湿，又能泻火解毒；苍术取其辛散苦燥，长于祛湿；牛膝引药下行，使湿自下去；车前子渗湿泄热，导湿热下行从水道而去，使邪有出路。再结合药水外敷，药效直接作用于患部，加速愈合。
验案2 患儿孙某，男，10月，20xx年4月3日就诊。就诊时见患儿双侧面颊布满红色皮疹，枕部皮疹稍稀疏，无破溃，瘙痒甚，纳差,舌红，苔黄厚腻。治以祛风止痒、利水渗湿。四妙丸加减：苍术6 g、黄柏6 g、茯苓15 g、白鲜皮10 g、金银花10 g、滑石10 g（包）、薏苡仁15 g，板蓝根10 g、荆芥6 g、甘草6 g、淡竹叶10 g、焦山楂10 g、炒麦芽10 g、焦神曲10 g、赤芍6 g、薄荷6 g（包）。3剂，水煎服，2 d 1剂，药渣泡水轻敷患部。服后皮疹颜色减轻且再未出现新的皮疹，纳差好转，仍瘙痒。6 d后复诊,上方去淡竹叶、炒麦芽、焦神曲、薄荷，加地肤子10 g、白蒺藜10 g,继服3剂，仍按上述方法服用，6 d后皮疹消失，诸症愈。
按
患儿饮食失调，脾失健运，内蕴湿热，外受风湿热邪而致皮疹。治以祛风止痒、利水渗湿。由于痒自风来，止痒必先祛风，祛风止痒以祛除在表之风邪，故加荆芥；面部湿疹严重者加薄荷、板蓝根。薄荷散头面风热，板蓝根可上行清热解毒。
3体会
《幼科发挥》云：“心火者，君火也。小儿诸疮，皆胎毒也。父母命门之中原有浮火，胚胎之始，儿则受之，既生之后其火必发为一切恶疮，名曰胎毒者是也。”婴儿湿疹是婴儿常见的皮肤病，其病机以内虚为本，“风湿热毒邪”外壅肌肤为标，治疗要标本兼顾，注意化湿、祛风、清热、解毒。为了减少此病的发生，孕母在孕期或新生儿期尽量少食诸如海鲜、腥辣、牛羊肉等肥甘厚物。
聚肌胞对人早孕绒毛外滋养细胞tlr3表达的调节作用
【关键词】 tlr3;poly(i:c);tev-1细胞株;流式细胞仪;平均荧光强度;荧光阳性细胞数;免疫细胞化学
【摘要】 目的 通过体外实验研究toll样受体3(tlr3)在人早孕绒毛外滋养细胞株tev-1的表达及聚肌胞polyi:c对tlr3 mrna和蛋白的调节作用。方法 体外培养tev-1细胞;用不同时间及浓度聚肌胞tev-1细胞后rt-pcr和流式细胞仪检测其tlr3 mrna和蛋白的表达变化;免疫细胞化学sp染色法检测tlr3蛋白的定位表达。结果 (1)polyi:c 可上调tev-1细胞株tlr3 mrna的表达(p<0.01)，且与时间和剂量呈正相关。(2) polyi:c 可上调tev-1细胞株tlr3蛋白表达的平均荧光强度(p<0.01);但荧光阳性细胞数12h与前比较差异无显著性(p>0.05);24h、48h的荧光阳性细胞数与时间和剂量呈正关(24h p<0.05;48h p<0.01)。(3)免疫细胞化学显示tlr3主要定位于tev-1细胞株的细胞浆。结论 tev-1细胞株tlr3的mrna及蛋白的表达与poly(i:c) 时间及剂量呈正相关;tlr3主要定位于tev-1细胞株的细胞浆，而细胞核及细胞膜没有观测到明显表达。wwW.0519news.cOM提示人早孕绒毛外滋养细胞可能通过细胞浆的tlr3参与早孕母-胎界面的免疫反应。
【关键词】 tlr3;poly(i:c);tev-1细胞株;流式细胞仪;平均荧光强度;荧光阳性细胞数;免疫细胞化学
[abstract] objective to investigate the regulatory effect of polyi:c on the expression of tlr3 mrna and protein in the human extravillous trophoblast cell line (tev-1)，and whether the regulatory effect depends on polyi:c’s dose and time.methods semi-quantitative rt-pcr ysis，flow cytometry and immuo-cytochemistry were used to dedect tlr3 mrna and protein expression level and location in tev-i cell line.results (1)the expression of tlr3 mrna in tev-i cell line significantly increased with the polyi:c’s stimulation time and dose increase; compare to without polyi:c’s stimulation(p<0.01).the mean fluorescence intensity of the tlr3 protein in tev-i cell line increased with the polyi:c’s stimulation time and dose increase; compare to without polyi:c’s stimulation(p<0.01).(2)the number of fluorescence positive cell of the tlr3 protein stimulated 12 hour had no statistics significance(p>0.05); but its increased with the stimulation time and dose increase in 24 and 48 hour intervention(24h p<0.05 ; 48h p<0.01).(3)the immuocytochemistry result revealed that tlr3 protein was expressed in tev-i cell line’s cytoplaa.however，it’s hardly to see the expression in the cellular membrane and nucleus.conclusion tlr3 protein was expressed in tev-i cell line and localized to the cytoplaa.the increase of mrna and protein expression of tlr3 in tev-i cell line depends on the increase of the dose and time for polyi:c’s stimulation.
[key words] tlr3，polyi:c;tev-i cell line; flow cytometry; average fluorescence intensity; the number of fluorescence positive cell
正常妊娠时母-胎界面存在着很强的免疫反应，其主要作用是促进胚胎植入和调节胎盘的发育，使母体对半异体来源的胎儿、胎盘产生耐受;同时，维持宿主防御反应，从而阻止病原微生物对机体组织和妊娠的破坏。母胎界面处的滋养细胞、免疫活性细胞及细胞因子，构成了母-胎界面的免疫微环境，对于妊娠的建立、维持、胎儿的生长发育以及分娩发动起着重要作用[1]。而妊娠病理(如:反复自发性流产、早产、子痫、胎膜早破、iugr等)则与母-胎界面的免疫微环境的改变有关[2]。因此，母-胎界面处细胞生物学和分子免疫学的研究已成为医学研究的热点之一。
天然免疫性细胞是可以通过对病原体表达的病原体相关分子模式识别各种病原体的。toll样受体是近年来发现的重要的免疫受体，它在天然免疫中通过对病原体相关的分子模式(pathogen-associated molecular patterns，pamp)的识别发挥作用，通过的级联反应导致细胞因子的产生和协同因子的表达，从而在天然免疫和获得性免疫中起到了桥梁的作用[3]。近年来的研究进展还发现toll样受体也广泛表达于女性生殖系统及母-胎界面，在局部抗感染、生殖免疫、妊娠免疫的生理及病理过程中发挥着重要作用[4，5]。本研究采用rt-pcr、流式细胞仪检测及免疫细胞化学sp法染色法测定toll样受体3(tlr3)蛋白在人早孕绒毛膜外滋养细胞株(tev-1)的定位及基因、蛋白表达和聚肌胞对其表达的影响，从而探讨tlr3在母-胎界面的表达及免疫作用。
1 材料与方法
1.1 细胞株来源 人早孕绒毛外滋养细胞株tev-1由香港大学馈赠。
1.2 试剂
单克隆小鼠抗人tlr3一抗：美国santa cruz 生物技术公司;羊抗小鼠igg荧光二抗(fitc标记)：购自美国kpl生物技术公司;引物：由上海博亚公司合成;poly(i:c)：美国sigma生物技术公司。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养
tev-1细胞株接种于细胞培养瓶，用dmem/f12培养液及10%胎牛血清的混合液4～5ml在培养箱中培养。待80%融合后，吸掉旧培养基，d-hanks液洗涤细胞1次，0.25%胰蛋白酶消化1～2min，在倒置显微镜下观察，当细胞将分离而呈圆粒状时，立即加入适量含血清的新鲜培养基终止胰蛋白酶的作用。再用吸管反复吹打细胞培养瓶壁使细胞脱落，并把细胞吹散至均匀。然后依1：3的比例转移至新的培养瓶中，以上述条件培养。
1.3.2 流式细胞仪检测tlr3蛋白在tev-1细胞株的表达
将tev-1细胞株种植于7个培养皿中培养，生长至80%融合后换成1ml的optin -mem培养液培养。6个培养皿中分别加入poly(i:c)12μg、25μg及分别培养12、24、48h，另一培养皿则不加。然后制成细胞悬液，无水乙醇固定，加入50μl 0.2% tritonx100破膜，pbs洗2次。加bsa稀释的单克隆小鼠抗人tlr3一抗100μl，4℃过夜，pbs洗2次。加bsa稀释的羊抗小鼠igg荧光二抗(fitc标记)100μl，4℃孵育30min，pbs洗2次,标本置流式细胞仪上检测。
1.3.3 rt-pcr
1.3.3.1 rna的提取
参照trizol试剂盒(美国gibcobrl公司)说明书进行提取rna。
1.3.3.2 逆转录cdna合成
将rna稀释为1μg/μl，取2μl rna加入1μl oligo (dt)15 (0.5μg/μl)、depc-h2o 7μl，充分混匀后，离心，在70℃孵育5min，迅速置于冰上，3min后离心;加入5×reaction buffer 4μl，dntp mix(10mmol/l)1μl，m-mlv reverse transcriptase(promega公司，200u/μl)1μl，depc-h2o 4μl;42℃孵育60min;95℃孵育10min灭活逆转录酶活性，然后置4℃以备作pcr用。
1.3.3.3 引物设计 见表1。表1 β-actin和tlr3引物序列
1.3.3.4 聚合酶链式反应(pcr) 扩增体系：10×taq buffer 5μl，mgcl2(25mmol/l) 3μl，dntp mix(10mmol/l)1μl，引物各(10μmol/l)1μl，cdna 2μl，taq 聚合酶(1u/μl)1μl，depc-h2o 36μl ;95℃预变性5min，94℃变性45s，54.4℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环，72℃终末延伸10min。
1.3.3.5 琼脂糖凝胶电泳 75v电压下2%琼脂糖凝胶电泳40min，紫外灯下观察条带。
1.3.3.6 采用英国uvp公司gds-8000型全自动凝胶成像仪扫描dna条带灰度值，用软件条带灰度比值。
1.3.4 免疫细胞化学sp法染色 将盖玻片置于细胞培养皿，将tev-1细胞株接种于其中，放入细胞培养箱培养进行细胞爬片;取出细胞爬片冰丙酮固定20min，细胞面向上固定于载玻片上;3%h2o2 封闭内源性酶;5%的正常山羊血清封闭;以 1：100浓度稀释的单克隆鼠抗人tlr3一抗湿盒内4℃孵育过夜;苏木素复染后脱水、透明、中性树胶封片。hmias-2000高清晰度彩色医学图文系统拍照。
1.3.5 统计学处理 所有数据均以均数±标准差(x±s) 表示,用spss 11.5统计软件进行数据,组间比较采用lsd 检验。
2 结果
2.1 tlr3 mrna的表达及变化 tlr3 mrna的表达随时间及剂量的梯度的上升而增加，与前比较，p<0.01(见图1、表2)。1泳道为前结果;2泳道为12μg、12h结果;3泳道为25μg、12h结果;4泳道为12μg、24h结果;5泳道为25μg、24h结果;6泳道为12μg、48h结果; 7泳道为25μg、48h结果;m为marker;530bp为β-actin扩增片段;334bp为tlr3扩增片段图1 tlr3的rt-pcr扩增产物检测结果表2 不同剂量及时间梯度poly(i:c)tlr3 mrna在tev-1细胞株的表达
2.2 tlr3蛋白的表达及变化 流式细胞仪检测tlr3蛋白的表达，平均荧光强度随时间及剂量的增加而上升，与前比较p< 0.01(见表3); 而荧光阳性细胞数12h与前比较差异无显著性(p>0.05);24h、48h随时间及剂量的增加而上升，p<0.05或<0.01(见表4)。表3 平均荧光强度 表4 荧光阳性细胞数
2.3 tlr3蛋白在免疫细胞化学的定位 免疫细胞化学(sp染色法)显示tlr3定位于tev-1细胞株的细胞浆(如图2)。图2 tev-1细胞株的细胞浆中可见到清晰的棕黄色颗粒，而细胞核及细胞膜则很难看见
3 讨论
近年来toll样受体在母-胎界面的表达及免疫功能研究备受关注。研究表明，tlr1-10的mrna及蛋白在滋养细胞和晚孕胎盘中都有表达，同时其相关分子和共受体cd14、md2、myd88也有表达。toll样受体通过识别配体，从而产生效应，其中tlr3识别的配体是病毒双链rna。目前有关tlr3在妊娠中的研究有：(1)国内外许多试验研究发现，腹腔注射大剂量polyi:c的小鼠流产率和胚胎吸收率增加，滋养细胞的tlr3被配体polyi:c激活后，细胞内il-2增加，il-10减少;而且巨噬细胞、nk细胞毒性增加。普遍认为，il-10是维持妊娠的重要因子，而il-2是已知的致流产剂。(2)masuhiro和shinsaku[6]检测了10种人类tlr和21种tlr相关基因分布情况，发现绒毛及胎盘组织中，tlr3水平居于最高(以早孕滋养细胞最突出)，该研究采用组织提取rna方法，对胎盘tlr3细胞定位未能提供进一步研究。
本试验进行了toll样受体其中之一tlr3在母-胎界面的重要细胞人早孕绒毛膜外滋养细胞株的表达及影响的研究。检测了人早孕绒毛膜外滋养细胞株tlr3 mrna及蛋白的表达，并且通过免疫细胞化学显示了tlr3蛋白定位(细胞浆);还检测了poly(i:c) (聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸;简称聚肌胞，是一种人工合成的双链rna)后tlr3 mrna及蛋白的表达的调节作用。tlr3 mrna的表达随时间及剂量的梯度的上升而增加，与前比较差异有显著性。流式细胞仪检测tlr3蛋白的表达，平均荧光强度随时间及剂量的梯度的上升而增加，与前比较差异有显著性;而荧光阳性细胞数12h与前比较差异无显著性;24h、48h随时间及剂量梯度的上升而增加，差异有显著性。说明了tev-1 细胞株tlr3的mrna及蛋白的表达与poly(i:c)时间及剂量呈正相关。但是荧光阳性细胞数12h与前比较差异无显著性，说明不同水平检测tlr3表达的灵敏度不同，或者可能是蛋白的表达滞后于mrna的表达造成的。
母-胎界面的toll样受体被激活后，通过myd88依赖或非依赖途径及核转录因子κb、jnk 等多条途径活化细胞，从而产生多种细胞因子及炎性趋化因子[7]：如il-6、il-8、gro-a、mcp-1、mcp-1a、rantes，这些细胞因子与白细胞的游走及机体防御有关。其中的趋化因子不仅便利了免疫细胞在蜕膜中的募集来保护机体和正常妊娠(例如:蜕膜中的巨噬细胞、中性粒细胞可以吞噬凋亡的滋养细胞)，而且被认为为正常的妊娠提供了免疫方面的支持。在胚胎种植期，胚胎附着、粘连所必需的整合素和粘连蛋白可能依赖于toll样受体激活后产生的前炎症因子的分泌[8]。toll样受体被激活后，可以直接激活凋亡级联反应酶caspase或产生tnf-α和ifn-γ等细胞因子诱发细胞的凋亡。绒毛滋养细胞的凋亡是正常妊娠的生理现象，大量形态学研究发现正常妊娠期伴随着绒毛滋养细胞的凋亡与分化，说明其凋亡与胎盘的形成、重塑相关。凋亡不仅可以去除衰老的合体滋养细胞，还能促进细胞滋养细胞融合而形成合体滋养细胞。toll样受体不但参与妊娠的生理过程，也与妊娠病理相关。很多研究发现，妊娠相关疾病，如早产、子痫、iugr、胎膜早破、反复自发性流产都与感染及toll样受体诱导的滋养细胞的过度凋亡密切相关。已经观察到，患羊膜炎及早产妇女的滋养细胞tlr-2或(和)tlr-3表达增高，而子痫前期患者的滋养细胞tlr-4表达增高。在妊娠相关疾病病例中，蜕膜组织中的巨噬细胞、中性粒细胞、nk细胞显著增高，而且其分布也发生改变[9]。这些改变了的免疫细胞的反应可能严重地破坏了正常的妊娠。tlrs可能作为“危险”与妊娠相关疾病的桥梁，诱发免疫反应，导致滋养细胞过度凋亡[10]。
随着对母-胎界面tlrs家族研究的不断深入，tlrs在妊娠期免疫应答中的作用及具体的作用机制将进一步被揭示。而且有望针对阻断tlrs通路，如核转录因子κb通路，而治疗妊娠相关疾病。
【参考文献】
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9 abrahams vm，kim ym，roberto r.macrophages and apoptotic cell clearance during pregnancy.am j reprod immunol,20xx,51:275-82.
10 shawn l，straszewski-chavez.the role of apoptosis in the regulation of trophoblast survival and differentiation during pregnancy，endocrine reviews,20xx,26 (7)：877-897.
【摘要】 总结了刘弼臣常用于治疗肺系疾病的八组“角药”的主治、功效、临床运用以及运用角药的特点。
【关键词】 刘弻臣;角药;肺系疾病
临床上将常用的、相对固定的两味药物的配伍形式,称为“药对”,这是中药配伍的最常用的形式，而三味药一组的配伍也是很常见的,并且源远流长，能够弥补“药对”所不能满足的临床病症，有人将此种配伍形式称之为“角药”，并认为它的组方意义远比“药对”广泛深厚[1]。刘弼臣教授为享誉全国的儿科专家，从事临床工作60余载，经验丰富，常善用“角药”来治疗儿科各种疾病，疗效显著。我们曾有幸随刘老侍诊抄方，并整理其临诊病历千余份，收益甚多。现将刘老运用“角药”治疗肺系疾病的经验整理如下，以飨同道。
1 作为主药部分之“角药”
1.1 辛夷、苍耳子、板蓝根
辛夷辛、温，入肺、胃经，具有散风寒、通鼻窍之功。苍耳子辛、苦、温，有毒，入肺、肝经，《本草备要》载其“善发汗，散风湿，上通脑顶，下行足膝，外达皮肤。治头痛，目暗，齿痛，鼻渊，去刺”。板蓝根味苦，性寒，归心、肾经，为清热解毒、凉血利咽之品，《本草便读》言其“清热解毒，辟疫，杀虫”。www.0519news.coM
刘老认为辛夷、苍耳子皆辛散性温，能入肺经，善散肺经风邪而通窍；板蓝根清热解毒利咽喉，能祛邪护肺安内宅。三药相配既能疏散风热、通鼻窍，又能内解热毒，清热利咽。同时刘老认为小儿“肺常不足”,不耐寒热,易为外邪所侵,而鼻咽为肺之门户，往往同时受邪，表现为鼻塞鼻痒、咳嗽咳痰、咽痛咽干等。对此刘老常以辛夷、苍耳子、板蓝根作为主药，与玄参、山豆根、牛蒡子、大青叶等同用，共奏疏风透邪、清热解毒、利咽通窍、防邪传变之效。此法也是刘老“精于五脏证治，突出从肺论治”思想的具体体现。
1．2 生黄芪、白术、防风
此三味药的配伍取自《世医得效方》中的“玉屏风散”，黄芪味甘微温，归脾、肺经，具有补气升阳、益卫固表、利水消肿、托疮生肌的作用，为补气升阳的要药；防风辛甘微温，性浮升散，善行全身，白术味苦、甘，性温，归脾、胃经，有补气健脾、燥湿利水、止汗、安胎的功效。《本经》称其可“主风寒湿痹死肌，痉，疸，止汗，除热，消食”。
刘老认为小儿肺常不足的生理特点决定了小儿易受外邪侵袭，常常前邪未去又添新邪，黄芪能补肺气、益卫气、固表止汗，配伍白术健脾以资气血之源，佐以防风走表而祛风邪。三药合用既可固表以止自汗，又能实卫而御外邪，使玄府闭合有度。故临床常作为主药治疗表虚卫阳不固的自汗及易受外邪、反复感冒的患儿。
1.3 南沙参、桑白皮、地骨皮
南沙参甘润而微寒，能补肺阴、润肺燥、清肺热，兼有补脾肺之气，清肺生津，补气化痰。桑白皮性味甘寒，归肺经。《本草纲目》曰：“桑白皮长于利小水，乃实则泻其子也，故肺中有水气及肺火有余者宜之。”故桑白皮具有泻肺平喘、利尿消肿之功。地骨皮甘、寒，入肺、肝、肾经，能直入阴分，泻肺中伏火，并退虚热，王好古称其“泻肾火，降肺中伏火，去胞中火，退热，补正气”。
此三味药的配伍是由泻白散变化而来，刘老认为桑白皮专入肺经，清泻肺热，平喘止咳；地骨皮甘寒入肺，清降肺中伏火，对于阴虚有热者尤宜，两药相合，清泻肺热，以使金清气肃；用南沙参代替原方中的甘草、粳米，在于增强方药的养阴清肺之力。三药相配清中有润、泻中有补，既可清泻肺中伏火以消郁热治其标，又能滋阴润肺治其本，对小儿“稚阴”之体起到标本兼顾的功效。临床中常用于咳嗽时间较长、痰多、痰不易咯出、舌红苔黄等病症的患儿。
1.4 葶苈子、紫苏子、莱菔子
葶苈子入肺、膀胱经，《药性论》记载其功效能“疗肺壅上气咳嗽，止喘促，除胸中痰饮”。紫苏子味辛，性温，无毒，归肺、大肠经。《本经逢源》载其：“性能下气，故胸膈不利者宜之……为除喘定嗽、消痰顺气之良剂。”故紫苏子善降气消痰、止咳平喘，并有润肠通便之功，利于肠中痰浊下降而利肺气；莱菔子味辛行散，即可消食导滞，又能降气祛痰、止咳平喘。
此三味药的配伍是由三子养亲汤变化而来，刘老用葶苈子代替原方中的白芥子，意在取葶苈子苦降辛散，性寒清热，专泻肺中水饮及痰火而平喘止咳，以增强泻肺平喘之力。三药相配，泻肺平喘，降气消痰，同时兼顾健脾消食。临床上症见咳嗽、气喘、痰多、纳差时，刘老常用葶苈子3 g、紫苏子5 g、莱菔子10 g作为主药，以泻肺平喘、化痰止咳。
2 作为次药部分之“角药”
2．1 前胡、杏仁、桔梗
前胡味苦辛，性微寒。辛能宣肺散风，苦能降气祛痰，性寒能清热。具有散风清热，降气化痰之功。桔梗辛宣苦降、开宣肺气、祛痰利气，同时能利咽、排壅肺之脓痰。杏仁味苦、微温，入肺、大肠二经。《本草纲目》称“杏仁能散能降，故解肌散风、降气润燥、消积治伤损药中用之”。杏仁能“宣”能“降”，且其辛温能祛肌表之邪，其味苦能令上逆之气肃降，有止咳平喘的功效。
刘老认为前胡可降气祛痰，桔梗可排痰利咽，两药相配止咳祛痰利咽的功效较好。而桔梗既升且降，以升为主，杏仁辛散苦降，以降为主，二药配伍，一升一降，升降调和，祛痰止咳之效甚佳。前胡能疏散风热，桔梗为开提肺气之药，可为诸药舟楫，载药上浮，两药相配，使邪从表而解。刘老在临床上治疗痰热郁肺，症见咳嗽、痰多伴鼻塞、咽干等症时，常化裁杏苏散来宣肺散邪、止咳化痰以调肺，方中就常用了前胡10 g、杏仁10 g、桔梗5 g以宣肺化痰。
2．2 芦根、竹叶、牛蒡子
《玉楸药解》言芦根的功效为：“清降肺胃，消荡郁烦，生津止渴，除烦下食，治噫膈懊侬。”既能清透肺卫气分实热，还可生津止渴、除烦、利尿。竹叶甘寒入心经，长于清心泻火以除烦，并能清胃生津止渴，兼能利尿。牛蒡子辛散苦泄，寒能清热，升散之中具有清降之性，功能疏散风热、宣肺祛痰、清热利咽、透疹。
刘老用这组药主要取芦根清肺胃之热，同时芦根配竹叶清热生津、除烦利尿，再加牛蒡子外散风热、内解热毒。临床症见发热、咳嗽、有痰、咽红、咽痛、口干、口渴，舌红、苔黄等，刘老常用止嗽散加鲜芦根30 g、竹叶10 g、牛蒡子10 g以疏风宣肺、止咳化痰、清肺生津。
2．3 枇杷叶、紫菀、百部
枇杷叶性味苦平，入肺、胃经。《本草纲目》曰：“枇杷叶气薄味厚，阳中之阴。”具有和胃降逆、降气止咳之功效，是治疗肺逆咳喘的良药。紫菀性味苦甘，微温，归肺经。《本经》载其“主咳逆上气，胸中寒热结气”。能温润肺气、开泄肺郁，具有下气化痰之功，为止咳要药。百部味甘，性微温，归肺经。《本草纲目》载：“百部亦天门冬之类，故皆治肺病杀虫。但百部气温而不寒，寒嗽宜之。”具有润肺下气、止咳、杀虫功效。
刘老认为枇杷叶苦平泄热，长于降逆；紫菀功善祛痰止咳，温而不燥，润而不腻，长于开泻肺郁、降逆定喘；百部甘润苦降，微温不燥。三药相用，降气祛痰，止咳润肺，化痰中寓润肺之意，润肺又不碍祛痰。临床症见咳嗽阵发、痰多、痰黄、咽红、舌红等时，刘老常用止嗽散或泻白散等配以枇杷叶15 g、紫菀10 g、百部10 g清热化痰、润肺止咳。
2．4 紫石英、秦皮、钩藤
紫石英甘温，能温散肺寒、止喘嗽、降逆平喘、温养肾阳,《药性论》言其主养肺气。据《本草汇言》记载, 钩藤能祛风化痰。秦皮归肝、胆、大肠经,《本草纲目》言其“气寒, 味苦, 性涩”, 苦寒可清利大肠, 性涩又可防止宣散太过, 有清热燥湿、平喘止咳之效[2]。
刘老认为, 小儿肺常不足, 肾常虚, 痰虽源脾驻肺, 与肾阳虚而不能暖土息息相关, 故用紫石英温养肾阳,以蒸运脾土, 土旺则金生, 无区区于保肺, 有治哮求本之意。秦皮、紫石英、钩藤既能温养肺肾，又能平喘止咳，是刘老推崇的治哮良药[2]，常与金银花、乌梅、紫菀、五味子等药配伍，用于哮喘、咳喘等疾病的治疗中。
3 讨论
角药是临床中药配伍中的一种方法，它源自于《内经》“一君二臣，奇之制也”的基础理论，始见于张仲景的《伤寒杂病论》[3]。刘弼臣教授在选取药物组成角药时有以下几个特点。(1)运用成方之角药,此种角药在从前的经方中就常运用到,如前文中提到的玉屏风散,常见的还有很多，如四逆汤、小陷胸汤、小承气汤、茵陈蒿汤[4]等。(2)由成方之角药化裁而来，是将原有的药换用其他药物，是根据小儿发病特点及生理病理特点，选取性味归经主治更有效的药物来配伍。(3)注重药物间相互配伍的关系，首先注重功效间的配伍，功效要能相互配合，不仅强调合用增强某方面的疗效，同时也强调顾护到疾病发生时会出现的兼证；其次注重性味间的配伍，做到升降得宜，宣散得度；最后是注重剂量间的配伍。从刘老的经验中看到，合理运用角药，在临床中能起到方便、有效的作用。
【参考文献】
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id-1在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达及意义
【关键词】 宫颈癌;宫颈上皮内瘤变;id-1;dna结合抑制因子-1;实时荧光定量rt-pcr
【摘要】 目的 通过检测宫颈癌及其癌前病变组织中dna结合抑制因子-1(id-1)蛋白和mrna的表达情况，探讨id-1在宫颈癌变过程中的作用。方法 采用免疫组化sp法检测id-1蛋白在15例慢性宫颈炎、17例cinⅰ、25例cinⅱ～ⅲ和79例宫颈癌组织中的表达;采用实时荧光定量rt-pcr法检测id-1 mrna在10例慢性宫颈炎、8例cinⅰ、9例cinⅱ～ⅲ和8例宫颈癌组织中的表达。结果 慢性宫颈炎、cinⅰ、cinⅱ～ⅲ、宫颈癌组织中id-1蛋白表达阳性率呈逐渐升高趋势(p<0.01)，分别为0、11.8%、40.0%、74.7%;cinⅰ、cinⅱ～ⅲ和宫颈癌组织中id-1 mrna的相对表达量分别是慢性宫颈炎组织的1.34倍、3.42倍和10.37倍，随宫颈癌变程度加重id-1基因表达增加(p<0.05)。结论 随着宫颈癌变程度加重，id-1表达逐渐增加，表明id-1可能参与了宫颈癌的发病机制。
【关键词】 宫颈癌;宫颈上皮内瘤变;id-1;dna结合抑制因子-1;实时荧光定量rt-pcr
[abstract] objective to investigate the effect of the inhibitor of dna binding-1(id-1)in the process of carcinogenesis of cervical cancer by detecting the expression of id-1 protein and mrna in the cervical cancer and its precancerous lesions.methods the expressions of id-1 protein in 15 chronic cervicitis, 17 cinⅰ, 25 cinⅱ-ⅲ and 79 cervical squamous cancers were assessed by immunohistochemical sp methods. real-time fluorescence quantitative rt-pcr (qrt-pcr) was used to detect the expression level of id-1 mrna in 10 chronic cervicitis, 8 cinⅰ, 9 cinⅱ-ⅲ and 8 cervical squamous cancers respectively.results it was found that the expression level of id-1 protein followed this pattern: cervical cancer > cinⅱ-ⅲ > cinⅰ> chronic cervicitis (p<0.01), and the positive expression rate of id-1 protein was 74.7%, 40.0%, 11.8%and 0.0% respectively. the relative amount of id-1 mrna expression in cinⅰ, cinⅱ-ⅲ and cervical cancer is respectively 1.34 times, 3.42 times and 10.37 times of that in the chronic cervicitis, which indicates that the id-1 mrna expression increases with the proceeding of cervical affection.conclusion the id-1 expression was increased with the aggravation of cervical lesions. it suggests that id-1 might have participated in the pathogenesis of cervical squamous cell carcinoma.
[key words] cervical cancer; cin; id-1; inhibitor of dna binding-1; real-time fluorescence quantitative rt-pcr
近年研究发现，dna结合抑制因子-1(id-1)作为一种转录调节因子在多种上皮来源的恶性肿瘤中表达升高，并且与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡及血管生成等有关[1]。WWw.0519news.Com目前对id因子与宫颈癌的相关研究国内外仅见一篇报道，即schindl等[2]的研究，但对id-1在宫颈癌变过程(慢性宫颈炎cinⅰcinⅱ～ⅲ→宫颈癌)中的研究尚未见报道。为此笔者采用免疫组化sp法和实时荧光定量rt-pcr法，首次定性与定量研究id-1蛋白和mrna在慢性宫颈炎、cinⅰ、cinⅱ～ⅲ和宫颈癌组织中的表达，初步探讨id-1在宫颈癌发生发展中的作用及意义，为宫颈癌的病因学研究和基因靶向治疗提供一个新线索。
1 材料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 免疫组化
选取我院病理科保存的20xx-20xx年宫颈癌变相关组织石蜡标本136例，患者年龄23～68岁，平均(42.56±8.20)岁。依据病理表现分四组，即慢性宫颈炎组15例、cinⅰ组17例、cinⅱ～ⅲ组25例、宫颈癌组79例。所有标本均由≥2名的病理学专家再次阅片确诊。选定的石蜡标本均经中性甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片。
1.1.2 实时荧光定量rt-pcr
经伦理委员会批准并取得患者知情同意后，选取20xx年10月-20xx年10月在我院行宫颈活检或子宫切除术的患者作为本研究对象。所有患者术前均未接受放、化疗或手术治疗。所取新鲜组织标本大小约0.5cm×0.5cm×0.5cm，液氮保存备用。最后根据病理结果纳入慢性宫颈炎组10例、cinⅰ组8例、cinⅱ～ⅲ组9例、宫颈癌组8例，共35例，年龄26～57岁，中位年龄37岁。阳性对照为卵巢癌1例，年龄55岁。
1.2 实验方法
1.2.1 免疫组化sp法检测id-1蛋白的表达
(1)一抗id-1兔抗人多克隆抗体购自美国santa cruz公司，免疫组化sp超敏试剂盒为天津津脉基因测绘技术有限公司产品。具体实验步骤按照说明书进行。以磷酸盐缓冲液(pbs)代替一抗作阴性对照，阳性对照由santa cruz公司提供。(2)采用olympus光学显微镜观察各试验组宫颈组织中id-1表达情况，由2名试验人员双盲法分别对试验结果进行半定量评分，最终结果取均值或协商确定。id-1免疫组化阳性着色主要定位于胞浆，为棕黄色或棕褐色。根据着色深浅和阳性细胞比例对免疫组化结果进行半定量评分，确定表达强度分级。具体评分标准见参考文献[2]。
1.2.2 实时荧光定量rt-pcr检测id-1 mrna的表达
(1)trizol提取组织总rna，-70℃保存备用。(2)id-1和β-actin基因引物和taqman探针由takara公司合成，见表1。(3)id-1基因为单外显子，逆转录前用dna酶处理。按照revert aid tm first strand cdna synthesis kit试剂盒(立陶宛mbi 公司)说明书进行操作，逆转录获得cdna。逆转录条件为20℃ 10min → 42℃ 60min → 70℃ 10min，-20℃保存备用。(4)标准曲线的制备：用假定初始拷贝数(x)的cdna模板按10倍梯度进行稀释，自每个稀释模板中取样2μl，分别加入30μl的反应体系中行实时荧光定量rt-pcr。扩增条件为94℃预变性2min;94℃ 20s，54℃(id-1)/52℃(β-actin)20s，60℃ 30s，45个循环;最后60℃延伸5min。将pcr仪的荧光采集时间统一设定在扩增反应的延伸期，在该时相读取ct值。(5)待测样本目的基因相对拷贝数的测定：将逆转录得到的cdna样品各取2μl，加入和上面完全相同的反应体系，在同样的反应条件下行pcr扩增，测定各样品的ct值，采用比较阈值法计算目的基因拷贝数=2-δδct，δδct=(ctid-1-ctβ-actin)试验组-(ctid-1-ctβ-actin)参照组。本研究目的基因为id-1，管家基因为β-actin，参照组为慢性宫颈炎组。2-δδct表示的是试验组目的基因的表达相对于参照组的变化倍数。表1 id-1和β-actin基因引物及探针序列
1.3 统计学 应用spss13.0软件系统对所得数据进行统计学处理，检验水准取双侧α=0.05。统计方法包括χ2检验、单向方差(one-way anova)。
2 结果
2.1 id-1蛋白在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达 慢性宫颈炎组织中未见id-1蛋白阳性表达，而宫颈癌及癌前病变组织中均有不同程度的id-1免疫阳性反应，主要定位于细胞质，表现为棕黄色或黄色颗粒样物质。id-1表达阳性率随宫颈癌病变程度的加重而升高，在慢性宫颈炎、cinⅰ、cinⅱ～ⅲ和宫颈癌组织中id-1阳性表达率分别为0、11.8%、40.0%和74.7%，差异有统计学意义(χ2=45.017，p=0.000)。见表2、图1。表2 id-1蛋白在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达水平
2.2 id-1 mrna在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达 见表3。对36例组织标本进行实时荧光定量rt-pcr检测，得标准曲线回归系数均>0.96，标准曲线拟合满意。id-1基因扩增效率为1.97，β-actin为1.99。可见，目的基因与管家基因的扩增效率基本相同，故可采用比较阈值法计算id-1基因拷贝数。cinⅰ、cinⅱ～ⅲ和宫颈癌组织中id-1 mrna的相对表达量分别为慢性宫颈炎组的1.34倍、3.42倍和10.37倍，差异有统计学意义(p=0.003)，id-1基因表达在宫颈癌组高于癌前病变组(p<0.05)，而在慢性宫颈炎组织中的表达低于宫颈癌(p=0.031)和cinⅱ～ⅲ组织(p=0.045)。可见，随宫颈癌变程度加重id-1基因表达增加。图1 宫颈癌及其癌前病变组织中id-1蛋白的表达情况表3 id-1 mrna在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达
3 讨论
3.1 id-1的结构与功能 id-1是分化和(或)dna结合抑制因子(inhibitor of differentiation and/or dna binding，id)家族成员之一，id因子是1990年由benezra等[3]首先从小鼠红白血病(murine erythro-leukemia，mel) 细胞 cdna文库中克隆出来的。id因子属于hlh转录因子，也是迄今为止发现的惟一具有负性调控hlh基因家族功能的调控蛋白。hlh蛋白是一类具有螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix，hlh)结构域的dna结合蛋白，id因子可通过hlh结构中的α-螺旋相互作用与其他hlh家族转录因子(主要为bhlh类转录因子)结合形成二聚体，但因其结构内缺乏碱性残基区使得这种二聚体无法有效地结合到dna上，不能发挥转录因子活性，从而抑制相关基因转录，产生生物学效应。在哺乳动物细胞中已发现4种id因子，即id-1～id-4。目前对id-1的研究最多，发现其参与细胞分化调控、抑制肿瘤细胞凋亡、诱导细胞永生化、促进肿瘤血管生成等[1，4，5]，在癌症发生发展中起重要作用。而且id-1在许多上皮来源的肿瘤，如食道鳞状上皮癌[6]、子宫内膜癌[7，8]、肺癌[9]、胃癌等均有高表达，推测id-1可能参与了这类上皮源性肿瘤的发生。
3.2 id-1在宫颈癌变过程中的作用 目前，关于id-1在宫颈癌变过程中表达情况的研究国内外尚无相关报道。仅schindl等[2]利用免疫组化方法研究发现早期宫颈癌中有id-1高表达，表达阳性率为79.2%。分别采用免疫组化sp法和实时荧光定量rt-pcr从蛋白和基因水平检测了慢性宫颈炎、cinⅰ、cinⅱ～ⅲ、宫颈癌组织中id-1的表达情况。免疫组化结果显示， id-1表达阳性率与宫颈癌病变程度密切相关，在慢性宫颈炎、cinⅰ、cinⅱ～ⅲ、宫颈鳞癌组织中id-1蛋白表达阳性率呈逐渐升高趋势(p<0.01)，分别为0、11.8%、40.0%、74.7%，而且id-1的染色强度也随病变加重而加深，所有的宫颈癌及其癌前病变组织中均出现不同程度的id-1免疫阳性反应;实时荧光定量rt-pcr检测结果也从基因水平进一步证实了免疫组化的结论，即id-1mrna的表达也随宫颈癌变程度加重而增加，cinⅰ、cinⅱ～ⅲ和宫颈鳞癌组织中id-1 mrna的相对表达量分别是慢性宫颈炎组织的1.34倍、3.42倍和10.37倍，差异有统计学意义(p<0.05)。综上结果提示id-1过表达参与了宫颈癌的癌变过程，在宫颈癌的发病机制中可能起到了重要作用，但具体致癌机制有待进一步研究阐明。
流行病学和分子病毒学已有相当多资料证明，人状瘤病毒(hpv)极有可能是宫颈癌的一个主要病因[10]。在持续hpv感染的基础上，由慢性宫颈炎cinⅰcinⅱ～ⅲ→宫颈浸润癌可能是大多数宫颈鳞癌的发病过程。但hpv感染并不能完全解释宫颈癌的发生，比如，前瞻性研究发现宫颈感染hpv16/18型者在1年内只有1/3发展为cin，以后也仅约15%将发展为宫颈癌，其余大部分均自行消退。可见宫颈癌的发生机制中，还存在其他hpv协同因素起重要作用。本研究结果初步显示了转录调节因子id-1与宫颈鳞状上皮癌变进展有关，推测在hpv持续感染的基础上，id-1可能与hpv e6/e7癌基因协同作用参与了宫颈鳞癌的发病机制，促进了宫颈癌变的持续恶性进展，但尚需更深入的研究证实。
细胞分化受阻引起无限增殖，导致细胞永生化是体外培养细胞恶性转化过程的第一步，也是体内肿瘤发生与发展进程的早期阶段。大量试验结果表明，id-1具有“永生化”癌基因的某些特性[11]，如抑制细胞分化、引起细胞持续增殖及血管持续新生等。id-1被认为是致癌性转化的一个重要调节因子。tang等[12]研究发现，kshv(卡波济肉瘤相关病毒) 感染人内皮细胞可诱导id-1表达增加，且内皮细胞增殖加快，提示id-l表达上调可能是细胞恶性转化的重要步骤。外源性表达id-1可通过抑制p16ink4a/rb和p53途径使细胞永生化，促进细胞不断增殖，最终形成肿瘤[4]。有研究显示，同时转染id-1和抗凋亡因子bcl-2可诱导成纤维细胞永生化[13]，仅id-1持续表达就可使皮肤上皮细胞的端粒酶活化，进而导致细胞永生化[4]。此外，id-1可以通过激活nf-κb途径抑制肿瘤细胞凋亡，通过激活mapk途径诱导癌细胞增生，促进肿瘤发生。ling等[15]的研究发现，通过基因转染上调前列腺癌lncap细胞id-1的表达，可增强nf-κb的反式激活及核转移，同时伴有下游效应因子bcl-xl和icam-1的表达上调，使肿瘤细胞凋亡受到抑制;而用反义寡核苷酸技术抑制id-1表达可抑制nf-κb的激活，使细胞对tnf-α诱导的凋亡敏感。在前列腺癌细胞lncap中id-1 的瞬间表达和稳定表达增加均可活化raf/mek1/2途径使癌细胞增殖明显加速，而当用mek1/2抑制剂pd098059阻断raf/mek1/2途径后，细胞周期s期的有丝受抑制，细胞生长速度减慢，提示mapk途径的活化在id-1诱导的前列腺癌细胞增殖中起重要作用[16]。
总之，本研究结果表明id-1在宫颈癌发生发展中起重要作用，靶向抑制id-1基因表达可能给宫颈癌的治疗带来新的希望。深入研究id-1在宫颈癌发病机制中的作用对宫颈癌的防治研究有重要意义。
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